中国抗癌协会

1.概述

随着科学技术的进步，特别是基因组学、蛋白组学以及各种高通量测序和分析技术的发展，肿瘤标志物的研究和发现已经进入了一个全新的时代。这些技术可以帮助科学家们更准确地识别和测量肿瘤标志物，从而提高癌症的早期诊断、预后评估和治疗效果监测的精度。肿瘤标志专业委员会继续在中国抗癌协会领导下秉承“创新模式、整合资源、发展共赢”理念，紧扣时代发展脉搏，不断促进国内外肿瘤标志物领域学术水平的提高，推动肿瘤标志物领域科学技术的普及和应用，为肿瘤防控事业贡献力量。在协会的领导下，肿瘤标志专业委员会积极开展学术交流活动，加强与国际肿瘤标志物领域的合作与交流，引进和吸收国际先进技术和经验，推动我国肿瘤标志物领域与国际接轨。同时，专业委员会还积极开展肿瘤标志物相关研究，推广肿瘤标志物新技术、新方法和新标准，为肿瘤诊断和治疗提供科学依据和技术支持。本文就2023年度肿瘤标志物领域研究进展及展望做一概览。

01 肿瘤甲基化标志物

DNA甲基化修饰是一种表观遗传现象，几乎伴随着肿瘤的发生、发展和治疗的全过程。因此，检测肿瘤甲基化标志物对肿瘤筛查、诊断和监测具有重要意义。随着甲基化检测手段和数据分析手段的进步，越来越多的肿瘤甲基化标志物被鉴定出来。所以，DNA甲基化分析可有效识别具有临床意义的肿瘤甲基化标志物。近年来，诸如：全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）、甲基敏感限制性内切酶测序（methyl-sensitive restriction enzyme sequencing，MRE-Seq）、简化的表观亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）等高通量技术（high-throughput technologies）的出现加速并扩展了人们对肿瘤发生的表观遗传机制的认识，揭示了大量具有潜在价值的癌症特异性表观遗传标记或特征，这些标记或特征可用于肿瘤诊断、预后预测或其对治疗的反应评估。[1][2][3]

对2023年临床肿瘤学产生重大科研影响的肿瘤甲基化标志物进行细致分类：基于肿瘤组织检测的肿瘤甲基化标志物，由于DNA甲基化发生在肿瘤发展的早期，有研究通过DNA甲基化和基因表达的整合分析，并利用机器学习方法，揭示了胃腺癌潜在的诊断和预后甲基化特征标志[4]，观察到甲基化和表达之间主要是负相关，而在高甲基化和低甲基化基因中，分别与基因表达主要呈现负相关和正相关[4]。该研究还观察到正常未甲基化的基因启动子 CpG 岛中 DNA 甲基化异常增加和相关基因沉默是癌症中最明显的表观遗传改变，而在反式调控中，高甲基化基因主要与基因表达呈负相关[4]；但是，也有研究发现低甲基化基因更可能与基因表达呈正相关[5]。总之，这些研究为胃腺癌引入了具有潜在应用价值的诊断和预后DNA甲基化标志物，但是需要进一步验证。同时DNA甲基化标志物可能显著提高对疑似胰腺癌患者的诊断质量，以及有望在经手术治疗的肺癌患者中检测微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）[6]和作为术后随访指标和成为指导前列腺癌检测的理想策略[7]；基于血液活检的肿瘤甲基化标志物，有研究开发了一种靶向DNA甲基化测序检测方法“甲状腺癌甲基化捕获”（thyroid-cancer-methylation-capture，ThyMet），主要用于测量血液中甲状腺乳头状癌特异性DNA甲基化标志物水平，旨在以非侵入性的手段对甲状腺乳头状癌分类[8]。在外周血单核细胞的肿瘤甲基化标志物中，国内学者XIE等[9]报道了一种基于DNA甲基化的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）检测方法，也有研究鉴定出了乳腺癌特异性DNA甲基化标志物。基于粪便检测的肿瘤甲基化标志物，新的DNA甲基化生物标志物也被提出可用于早期检测结直肠癌和癌前病变；基于尿液的肿瘤甲基化标志物，膀胱尿路上皮癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，基于尿液的表观遗传学标志物有望成为检测尿路上皮癌的可靠工具[10][11]同时在子宫内膜癌的筛查上，DNA甲基化标志物提供了一种应用简单且对患者友好的癌症筛查方法[12]；基于阴道分泌物的肿瘤甲基化标志物，目前，已有研究通过卫生棉条收集的阴道分泌物进行子宫内膜癌筛查，通过使用子宫内膜癌、良性子宫内膜和良性宫颈阴道组织的DNA作为样本，根据ROC鉴别度、甲基化水平在肿瘤和对照之间的变化倍数以及无背景CpG甲基化选择候选差异甲基化区域[13]；基于多组织来源的DNA甲基化泛癌标志物，为了更好地研究肿瘤发生和转移过程中细胞的表观遗传模式，有团队开发了一种独特的可用于全基因组DNA甲基化检测手段——导向定位序列（guide positioning sequencing，GPS） ，可在4亿个读取中覆盖高达96%的CpG位点[14]，利用GPS分析癌细胞系数据，经常遇到一种独特的现象：在多种类型的癌症样本中，有许多区域似乎异常高甲基化，该发现随后被验证为泛癌标志物（universal cancer only markers，UCOM）。根据TCGA数据库中来自 17 种癌症的 7 000 多个样本确定了第一个UCOM——HIST1H4F，它是一种在所有类型的癌症中高甲基化的组蛋白相关基因[15]。UCOM已被证明具有4个主要特征：恶性肿瘤特有、全有或全无、癌症超早期检测、易于检测，这些特征使UCOM能够超越当前生物标志物的功效[15][16]。目前，UCOM在多种癌症的诊断中表现出很强的潜力，但仍存在许多未知数，例如需要进一步积极探索UCOM为何普遍存在于癌症中，UCOM背后的表观遗传调控机制也值得进一步研究，这可能为癌症治疗提供新的方向。

02 液体活检标志物

液体活检技术作为一种新兴的检测技术，涵盖了不同类型的肿瘤相关物质，肿瘤来源的生物标志物主要包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）和肿瘤教育血小板（tumor-educated platelets，TEPs）等，具有创伤小、可重复性强、成本低等优点，可以非侵入性地反映体内肿瘤的状态，2023年，液体活检标志物在肿瘤诊断和治疗领域的应用更加深入和广泛。

在液体活检标志物的检测技术的新进展上，CHENG等[17]使用广谱游离DNA测序在血浆中鉴定了一类新型约50 nt超短单链游离DNA，它与167 bp单核小体游离细胞DNA明显不同，具有不同的生物学过程以及FE峰、片段组学、末端基序和G-Quad特征，可作为一类独特的生物标志物。SAURA等[18]从乳腺癌患者收集的母乳中发现存在ctDNA，通过液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）分析母乳的ctDNA，该研究开辟了母乳作为液体活检新来源的潜在用途。2023年，STOECKLEIN等[19]通过采用诊断性白细胞分离术来筛查大血容量（约2.8 L）以提高CTCs检测的灵敏度，将M0期胰腺癌患者的CTCs检出率提高到44%，在M1期患者中提高到74%，而且使CTCs计数增加了60倍，能够为基因组分析提供足够的CTCs。EVs是液体活检的理想选择，但区分肿瘤衍生的EV和体液中含有生物标志物的EV亚群一直具有挑战性。2023年，KO等[20]发现糖蛋白CD147+EV主要来源于肿瘤细胞，与健康个体和良性疾病患者相比，循环中的CD147+EV在卵巢癌和肾癌患者的阳性率显著增加。该研究还发现，通过CD147免疫捕获分离的循环miRNA较通过常规方法分离的循环miRNA更接近反映肿瘤miRNA的特征，因此CD147免疫捕获可能是分离肿瘤衍生miRNA进行液体活检的有效方法。膜蛋白是细胞外囊泡和颗粒（extracellular vesicles and particle，EVP）常用的标志物，但无法满足临床要求的诊断准确性。ZHAI等[21]用干涉等离子体显微镜研究膜蛋白表达水平、与适配体的结合动力学和EVP大小之间的相关性，结果发现5种蛋白质标志物的选择性膜蛋白表达水平及其结合动力学在各种大小的EVP中具有高度异质性，并使用机器学习算法分析膜蛋白和EVP大小之间的相关性，其区分肿瘤类型的总体准确率可以提高到85%。2023年，RUI等[22]采用小RNA测序分析血清外泌体中的piRNA，筛选出了253个差异表达的血清外泌体衍生的piRNA，其中来自HCC的血清外泌体衍生的piRNA显示出独特的表达谱，说明外泌体中的piRNAs可能作为HCC诊断的生物标志物。CAMPOLO等[23]在对胃肠胰神经内分泌肿瘤患者的TEP样本进行RNAseq分析时，鉴定出了差异表达的252个circRNAs，首次证实了来自TEP的circRNAs特征可能作为肿瘤潜在诊断和预测生物标志物。

2023年，液体活检标志物研究在肿瘤的早期诊断方面取得了新的进展，因此有可能实现超灵敏的早期肿瘤检测和准确的肿瘤组织起源定位。同时液体活检标志物在癌症耐药性检测中的应用正在不断发展，包括化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种治疗方式以及通过监测液体活检标志物的动态变化，可以预测肿瘤的复发转移风险和预后，从而指导临床医生及时采取必要的干预措施。但是将液体活检应用于临床精准医疗，仍然有一定局限性。

03 线粒体肿瘤标志物

线粒体是细胞能量代谢的主要场所，也是线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、钙离子稳态调节及细胞凋亡的核心调控部位。线粒体代谢异常与肿瘤恶性表型密切相关。

有关肿瘤细胞内线粒体代谢改变2023年研究热点聚焦于糖酵解相关蛋白表达调控上。XUE等[24]发现，肿瘤代谢的“逆向Warburg 效应”通过糖酵解产生L-乳酸和酮体驱动肾癌细胞中Akt、mTOR和p70 S6激酶磷酸化以及HIF-1α/VEGFA的表达，为肿瘤细胞代谢提供能量。此外，肿瘤细胞中葡萄糖转运蛋白（glucose transporter type 1，GLUT1）和己糖激酶2（hexokinase type 2，HK2）异常表达与肿瘤细胞线粒体糖代谢异常的发生呈正比，此种异常表达也与多种肿瘤的转移呈正相关[25]。三羧酸循环中关键产物或酶的突变或失调对癌细胞增殖、转移和凋亡起着重要作用，可以作为线粒体代谢重编程肿瘤标志物之一。YUAN等[26]发现，在肝癌细胞中，琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）突变导致琥珀酸盐积累，SDHA/B减少通过促进cullin1的脱乙酰作用并抑制YAP/TAZ蛋白酶体降解，诱导糖酵解移位，促进肿瘤增殖。MILLER等[27]在神经胶质瘤中发现，异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）发生致癌性突变，将α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutaric acid，2-HG），从而影响细胞正常分化，促进肿瘤生成。此外，LYU等[28]发现IDH异源二聚体内NADPH结合位点的复发性突变以顺式或反式方式阻止稳定的酶抑制剂复合物形成，而IDH抑制剂可减少2-HG产生，从而让急性髓系白血病患者获得临床缓解。大多数肿瘤细胞中存在TP53基因突变，其可能通过影响TIGAR和SCO2的表达影响细胞色素c氧化酶复合体，导致线粒体呼吸作用下降，促进肿瘤细胞有氧糖酵解。[29]因此，靶向线粒体代谢重编程中氧化磷酸化相关标志物可能是调控肿瘤细胞糖代谢的关键之一。

MALHOTRA等[30]最新研究表明，肿瘤组织或转移灶中的mtDNA可释放到外周血循环中，检测外周血循环中的mtDNA变异在肿瘤早期诊断、肿瘤进展以及转移方面有巨大的应用前景。线粒体动力学包括线粒体分裂与融合，其失衡表现为分裂过程增强和（或）融合过程减弱[31]。线粒体分裂与融合相关蛋白改变可提示细胞发生恶性转化，如在胃癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中均发现分裂相关蛋白表达升高，融合相关蛋白表达降低[32][33]。线粒体融合蛋白（mitochondrial fusion protein，MFN）和视神经萎缩蛋白1（optic atrophy-1，OPA1）功能改变会导致线粒体融合减少。在肝癌细胞中，线粒体蛋白FUN14结构域（FUNDC2）与MFN1相互作用可抑制MFN1介导的线粒体融合，致使肿瘤细胞内线粒体形态延长及代谢重编程，促进肿瘤生长[34]。探索调控线粒体分裂与融合相关蛋白表达靶向干预肿瘤发生发展进程的作用机制也是目前2023年线粒体肿瘤标志物研究的一大热点话题。同时线粒体质量控制失调可以作为监测肿瘤发生发展的标志，肿瘤细胞的恶性表型与其抗凋亡特性有关，多种肿瘤细胞中可见凋亡相关蛋白BCL-2高表达。WU等[35]发现，胃癌细胞中，BCL-2表达增加抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）诱导的细胞凋亡，而凋亡促进因子Bax和Bak能激活Bax/Bcl-2/caspase3信号通路导致线粒体功能损伤，从而促进肿瘤细胞凋亡。线粒体凋亡不仅与肿瘤恶性表型相关，而且与肿瘤治疗及耐药性关系密切，大多抗癌药物通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗癌效应。凋亡异常如BCL-2过表达、p53失活或通过干扰Nrf2/NF-kB信号通路等抑制细胞凋亡，可使肿瘤细胞对抗癌药产生多种耐药性[36]。抗凋亡和促凋亡蛋白表达水平的动态平衡有望作为一组新的预测肿瘤化疗敏感性的标志物。

04 肿瘤单细胞与空间多组学标志物

单细胞组学技术能从单细胞分辨率解析瘤内异质性和细胞间交互，空间组学技术则从空间维度探究异质性与肿瘤微环境。空间转录组技术与单细胞转录组数据的整合分析研究，可从空间维度构建肿瘤细胞图谱，有助于研究者更全面地了解肿瘤的发生、发展过程。有研究对31例结直肠癌患者样本的免疫荧光、空间转录组及单细胞转录组进行分析，构建了结直肠癌演化的分子图谱，揭示了结直肠癌细胞的个体化生长轨迹[37]。另有研究通过将组织学与通过循环免疫荧光（cyclic immunofluorescence，CyCIF）获得的单细胞成像数据相结合，绘制了结直肠癌的二维图谱，并将二维图谱拼接重建三维图谱，这有助于更加深入理解有关正常组织和结直肠癌组织之间的差异以及肿瘤异质性等关键问题[38]。

单细胞组学技术可用于研究细胞异质性（cellular heterogeneity），揭示瘤内细胞的遗传和表型差异，即细胞状态或细胞分群。同时，细胞并非游离存在组织中，而是具有时空特异性。空间组学技术主要用于解析空间异质性（spatial heterogeneity）。但现有的空间组学技术在分辨率和基因水平通量上不能兼顾，其与单细胞组学的联合分析在探索肿瘤异质性方面提供了一个多维度、全面的视角，通过整合分析，以期提高空间组学数据的分辨率，进而为从多维度揭示肿瘤细胞的异质性提供了新思路。因此，通过单细胞与空间多组学技术研究肿瘤内异质性是当前癌症研究领域的一个前沿、热点方向之一[39][40][41]。同时单细胞与空间多组学技术为深入剖析肿瘤微环境中的细胞多样性和复杂性，明确肿瘤发生、发展及肿瘤逃逸机制等提供了新的途径。

05 肿瘤蛋白生物标志物

2023年，在针对细胞膜定位肿瘤蛋白生物标志物的研究中，细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）、程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）、内皮糖蛋白（endoglin，ENG）和分化簇14（cluster of differentiation 14，CD14）在表征肿瘤治疗反应、预后等方面的作用取得较大突破[42][43][44][45][46][47]。在细胞质定位的肿瘤蛋白生物标志物研究中，发现了波形蛋白（vimentin）、tRNA甲基转移酶61B（tRNA methyltransferase 61B，TRMT61B）、开放阅读框1蛋白（open reading frame 1 protein，ORF1p）、磷脂酰肌醇-聚糖生物合成L类（phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class L，PIGL）和BNIP3在肿瘤诊断、复发预测及表征预后等方面的作用[48][49][50][51][52]。位于细胞核的去乙酰化酶（sirtuin 1，SIRT1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A，p21）、组蛋白赖氨酸三甲基转移酶（SET domain containing 2，SETD2）以及剪接因子3b亚基4（splicing factor 3b subunit 4，SF3B4）作为肿瘤生物标志物的研究取得了显著进展^{[53][54][55][56]。}

在分泌型蛋白的研究方面，C反应蛋白（C reactive protein，CRP）、金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）、血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）、基底膜（basement membrane，BM）蛋白、AFP、血浆前胃泌素释放肽（plasma progastrin-releasing peptide，ProGRPp）和免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）作为肿瘤蛋白生物标志物相关领域在2023年取得较大突破^{[57][58][59][60][61][62][63]}。肿瘤蛋白生物标志物的一系列研究主要集中于非侵入性的血液生物标志物联合诊断方法，这方面的成果占比大，影响力大，热点问题集中于HCC的早期检测，HCC的早期识别能显著提高治疗效果并改善患者预后。

06 肿瘤代谢标志物

围绕肿瘤物质与能量代谢的相互调节，揭示肿瘤发生发展的致病机制，挖掘潜在代谢标志物仍是2023年肿瘤代谢标志物的研究的热点。

近年研究发现，多数糖酵解和糖异生酶具有非代谢功能，并且能够直接参与肿瘤细胞基因表达的调控[64]。有氧糖酵解及其下游丙酮酸循环、TCA循环等糖代谢过程相关通路的关键分子一直是肿瘤代谢标志物研究的焦点之一。目前，肿瘤糖酵解代谢标志物主要是一些关键酶和转运体，比如葡萄糖转运体、己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等。此外，研究发现代谢产物也是预测肿瘤进展的重要生物标志物。氨基酸是细胞生长的基本营养物质，除必要氨基酸代谢，如甲硫氨酸代谢、精氨酸代谢、亮氨酸代谢等参与调节肿瘤进展以外，一些非必要氨基酸代谢如脯氨酸代谢、丝氨酸代谢和酪氨酸代谢也与肿瘤细胞增殖和侵袭等密切相关，MOSSMANN等[65]发现，在小鼠和人肝癌细胞中精氨酸高表达并与RNA结合基序蛋白39（RNA binding motif protein 39，RBM39）结合，促进天冬酰胺合成，增强精氨酸摄取，且此正反馈回路可维持高精氨酸水平，促进肿瘤生长。Nat Metab发表的一项研究显示，正常肠道的淋巴细胞中脯氨酸代谢显著富集，而肠炎的淋巴细胞中脯氨酸摄取减少，IL-22表达水平减少，进而加重小鼠结肠炎[66]。氨基酸代谢在铁死亡调控中也发挥重要作用。在乳腺癌、黑色素瘤等多数肿瘤中甲硫氨酸水平升高，通过转氨作用转化为半胱氨酸保护癌细胞免于铁死亡[67]。此外，谷氨酰胺、丝氨酸和天冬氨酸等重要氨基酸的异常代谢对肿瘤生长及侵袭转移也具有重要意义[68][69][70]。核苷酸代谢是细胞内核酸（DNA和RNA）的合成和分解过程。紊乱的核苷酸代谢是癌细胞的一个普遍特征，肿瘤细胞的过度增殖、化疗抵抗、免疫逃避和侵袭转移等都高度依赖于增强的核苷酸代谢。ZOU等[70]通过结直肠癌患者样本的转录组学分析显示，COP9 信号体复合体亚基 CSN6 的表达与嘌呤和嘧啶代谢之间存在显著正相关，且CSN6可促进磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）的表达，上调嘌呤和嘧啶的生物合成，从而降低结直肠癌细胞在体内外的化学敏感性。脂质代谢是生物体内脂质合成、降解和转运的过程。在癌症发展的不同阶段，脂质代谢呈现出普遍性增强，为肿瘤细胞提供了特殊的能量来源，在维持生物体的能量平衡和细胞稳态等方面发挥了重要作用。研究表明，在多数肿瘤中脂肪酸合成的中间代谢产物丙二酰辅酶A（Mal-CoA）上调，且与ATP竞争性结合抑制mTORC1及其下游通路活性，进而抑制肿瘤进展[71]。肿瘤免疫交互会改变免疫细胞和肿瘤细胞的代谢和表观遗传修饰，那些参与调控的关键分子是指示肿瘤发生发展的重要标志物，TANG等[72]研究表明，ATP代谢关键酶CD73在胰腺癌细胞表面异常高表达，导致腺苷在细胞外积聚，直接抑制肿瘤浸润淋巴细胞。2023年分别发表在Sci Adv和Front Immunol的研究发现，在肝癌和肺癌中腺苷积累可导致肿瘤免疫抑制，提示腺苷是重要的肿瘤代谢标志物之一[73][74]。同时，肿瘤细胞为了满足其快速增殖或存活的需求，会改变一些重要的代谢途径，而其代谢途径的改变往往会伴随着氨的生成。

【主编】

邢金良    空军军医大学

聂勇战    空军军医大学附属西京医院

曾木圣    中山大学肿瘤防治中心

谢晓冬    北部战区总医院

【副主编】

陈奎生    郑州大学第一附属医院

袁响林    华中科技大学同济医学院附属同济医院

王书奎    南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院

宋现让    山东第一医科大学附属肿瘤医院

黄灿华    四川大学华西基础医学与法医学院

张媛媛    四川大学华西基础医学与法医学院

于文强    复旦大学生物医学研究院

吕   斌    南华大学

孙世权    西安交通大学公共卫生学院

缪洪明    陆军军医大学

杨   帆    重庆大学附属中心医院

李   伟    复旦大学生物医学研究院

葛圣阳    复旦大学生物医学研究院

谢   丽    山东第一医科大学附属肿瘤医院

黄启超    空军军医大学

席文文    南华大学

【编委】

葛圣阳    复旦大学生物医学研究院

吕艺蓁    西安交通大学公共卫生学院

孙晓东    四川大学华西基础医学与法医学院

周昕萌    四川大学华西基础医学与法医学院

廖青青    四川大学华西基础医学与法医学院

谢   娜    四川大学华西基础医学与法医学院

陈   瑶    重庆大学附属中心医院

黎   莉    重庆大学附属中心医院

冯天琳    重庆大学附属中心医院

郭   旭    空军军医大学

徐治洪    空军军医大学

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