流式细胞术远不够？——国内专家首次报道NB5技术在检测神经母细胞瘤微小残留病灶中的优异表现


       虽然MIBG一度被认为是神经母细胞瘤转移病灶的诊断金标准，但影像学检测无法量化残留病灶或识别新出现的微小残留病灶（MRD）。常规形态学检测的灵敏度仅为10-3，而MRD通常指的是分子层面检测，主要技术包括流式细胞术和RT-PCR，后者是近年来MRD领域广泛应用的检测技术，其灵敏度可高达10-6。多项研究已经证实，通过RT-PCR检测外周血（PB）和骨髓（BM）中的NB相关mRNA可评估疾病负担，提供较为全面的预后信息。

       目前，多个mRNA已被证实仅在NB肿瘤细胞中高表达，而在正常人体内几乎不表达或仅在骨髓或外周血单个核细胞中少量表达，包括CHGA，DCX，DDC，PHOX2B，TH。这些基因在肿瘤成熟与分化中发挥重要作用，故评估它们的表达在NB检测中具有很大的临床价值。此外，基于NB的高异质性，与单一标志物相比，评估标志物组合的检测结果准确性更高，2017年国际神经母细胞瘤反应标准（INRC）明确指出使用RT-PCR评估MRD至少检测TH和PHOX2B。

       近日，湖南省人民医院的贺湘玲主任团队在《Translational Pediatrics》发表了题为“RT-PCR demonstrates superior sensitivity and specificity in detecting the five neuroblastoma genes compared to the flow cytometry method for measurable residual disease”的研究。该研究利用RT-PCR评估了上述5个基因在神经母细胞瘤疾病进展中的敏感性和特异性，并进一步确定了NB5检测在评估转移、残留疾病和患者预后方面优于流式细胞术。


      研究结果

       1. 患者和样本特征
      本研究共纳入71例新诊断的NB患者。71例患者中，男性患者略多于女性患者（44 vs 27），中位年龄为5岁，92.958%的患者属于高危组。
       2. 基于NB5表达水平的临床生物学特征比较
使用30例来自中国人群的阴性BM标本和100例来自NB患者的BM标本建立了基线，研究把Ct（阈值周期）阳性值设置为39，ΔCt阳性值设置在18以下。在这5个基因中，如果至少有一个基因的ΔCt值低于18，则确定为阳性结果。最终确定了38例患者为NB5阳性组，75例为NB5阴性组。
       NB5阳性组与阴性组患者比例的差异性与诊断时间点（p=0.043）、流式细胞术评估结果（p＜0.001）、骨髓形态学评估结果（p＜0.001）和疾病状态（p＜0.001）显著相关。以流式细胞术评估结果为例，流式细胞术阳性的患者100%NB5检测阳性，但流式细胞术阴性的患者，23.684%NB5检测阳性，76.316%NB5检测阴性。



表1.基于NB5检测方法的临床特征比较

3. 利用qRT-PCR检测BM和PB标本中的NB5表达

本研究共纳入21对BM和PB标本。PB标本与BM标本的阳性结果一致性为100%。此外，与PB标本相比，BM标本显示了额外的5个阳性结果。
       值得注意的是，BM的ΔCt值在所有基因中均低于PB。这些结果表明，PB中NB细胞的浓度低于BM。在qRT-PCR检测到5个基因强表达的样本中（ΔCt<10），BM中TH、DCX、DDC、PHOX2B和CHGA的ΔCt值分别为7.008±0.745、5.211±1.183、5.552±1.050、4.309±1.256和4.736±1.076，表达强度均高于PB。

图1.NB5检测骨髓与外周血ΔCt的相关性分析

注：R2是相关指数，R2越接近于1，表明x与y之间的相关性越强；R2越接近于0，表明两个变量之间几乎没有直线相关关系


       4. 不同标本中的NB5 ΔCt值与临床疾病状态之间的关系
       结果显示，所有5个基因的ΔCt值与流式细胞仪MRD的肿瘤细胞含量呈负相关。在88份骨髓样本中，NB5检测有30例（34.091%）呈阳性，显著高于流式细胞术（17.045%）。NB5阳性结果比例比流式细胞术阳性结果比例高出17.046%，而这部分患者在后期均有不同程度的疾病进展或治疗效果不佳。


图2. NB5 ΔCt水平与MRD结果的相关性分析

注：R2是相关指数，R2越接近于1，表明x与y之间的相关性越强；R2越接近于0，表明两个变量之间几乎没有直线相关关系

       NB5在BM标本中的表达水平随疾病状态的变化而变化。在不同的疾病状态中，5个基因的表达均有显著差异，与疾病缓解组（完全缓解、部分缓解、非常好的部分缓解）相比，疾病稳定组具有较低的ΔCt值。

图3.不同疾病状态BM标本的NB5 ΔCt水平

*, P<0.05; **, P<0.01

       5. 利用ddPCR和qRT-PCR检测和分析BM、PB和脑脊液标本中的NB5表达

      研究对24例不同来源的标本进行了ddPCR检测。结果显示，在BM（13/18,72.222%）和脑脊液（1/1,100.000%）中，ddPCR的阳性率与qRT-PCR的阳性率一致。而在PB（2/5,40.000%）中，ddPCR的阳性率高于qRT-PCR。

 表2.不同样本的ddPCR和qRT-PCR结果的比较


       6. 每种NB5基因对疾病阳性结果的贡献

       共38例标本经qRT-PCR检测为阳性，研究评估了5个基因在阳性标本中的频率，并使用卡方检验来确定是否有显著性差异。结果显示，CHGA基因和TH基因在两两比较中存在显著性差异（P=0.005），其他基因的两两比较无显著性差异。因此，将这5个基因的贡献进行了如下排序：CHGA≈DCX≈DDC≈PHOX2B，而CHGA基因的贡献高于TH基因。

表3.利用RT-PCR检测出NB5阳性的结果

字母“a”和“b”表示是否存在统计学差异；包含相同的字母表示无显著性差异，否则表示有显著性差异

       7. NB5评估结果与PFS的关系

      结果显示，尽管基于流式细胞术、BM形态学或NB5ΔCt评估的患者PFS没有显著性差异，但基于NB5ΔCt的分组显示出更好的预后分层的趋势。

图4.不同MRD检测方法对NB患者PFS的影响（A：NB5检测阳性与阴性患者的PFS；B：流式细胞术检测阳性与阴性患者的PFS；C：骨髓形态学检测阳性和阴性患者的PFS；D：在流式细胞学检测为阴性的患者中，依据NB5检测结果分为阳性和阴性组的PFS）

       为了进一步评估NB5 ΔCt在预后分层中的意义，研究分析了流式细胞术阴性患者的PFS与NB5 ΔCt的相关性。将患者分为NB5阳性组（NB5 ΔCt ≤18）与NB5阴性组（NB5 ΔCt >18）。在初诊时，阳性组患者的平均生存时间为27.408个月，显著低于阴性组（35.961个月，P=0.034）。此外，Cox分析显示，在流式细胞术阴性患者中，NB5 ΔCt阳性组的HR是NB5 ΔCt阴性组的3.046倍。这一结果表明，与流式细胞术MRD相比，NB5能够更准确地评估疾病进展和预后，可作为评估疾病状态和预后的一种独立因素。
研究进一步分析了单个基因与预后的关系，结果显示对预后影响最大的单个基因是DCX，其曲线下面积（AUC）为0.733。如果去掉DCX基因，AUC将下降6.589%。由DCX基因预测的PFS具有最高的AUC（DCX>DDC>PHOX2B>CHGA>TH），而NB5 ΔCt的AUC预测值介于DCX和DDC之间。 

表4.不同基因对AUC的独立贡献

研究总结

       与流式细胞术检测相比，NB5检测MRD能够更准确地反映NB患者的骨髓疾病状态，同时这种检测方法的评估结果可作为复发或难治性NB患者的独立预后因素，在早期识别肿瘤复发。此外，基于BM的NB5检测在灵敏度和精确性上优于基于PB的NB5检测。这些结果支持探索NB5检测作为进一步预后分层和监测复发或难治性NB的方法。

      研究讨论

      上述研究结果均是基于所有入组人群得出的，不妨来看看研究者额外选取的具有代表性意义的个例，更进一步了解NB5检测方法的潜力。
       首先，NB5检测在预测患者疾病早期复发方面具有优势。研究者指出，1名患者最初的NB5检测结果呈阳性，但流式细胞术的MRD结果呈阴性。6个月后，随访BM检查显示NB5、流式细胞术和BM形态学检测均为阳性。而另1名患者的第一次和第二次NB5检测均为阴性，并处于维持治疗阶段。在第三次NB5检测中，5个基因均为阳性，但BM形态和流式细胞学检测结果均为阴性。此外，影像学检查未发现任何复发的迹象。密切随访监测该患者，半个月后再次检查发现左肾门、双侧下颌分支、双侧髂骨、右侧坐骨病灶附近MIBG摄取，提示骨转移。居里评分为5分，表明疾病复发。这2例患者资料均反映在评估患者骨髓状态方面，NB5检测比流式细胞术更加敏感和准确。此外，当NB5检测结果从阴性转为阳性时，可以更早地预测神经母细胞瘤复发，从而实现早期干预。
       此外，NB5检测在评估治疗效果方面的精准性同样很高。在1名3岁女孩中，第一次BM NB5检测到TH和DDC呈阳性，流式细胞学结果也呈阳性。继续诱导治疗后，第二次检测显示流式细胞学结果为阴性，但TH和DDC基因仍呈阳性，最终证实患者骨内有多个病变。这一结果说明，对于复发难治性患者，即使在流式细胞术为阴性的情况下，NB5结果仍然可以准确预测PFS，未来NB5检测可以使复发或难治性患者在治疗前和治疗期间进行早期风险分层。

       本文由湖南省人民医院的贺湘玲教授担任点评专家，文章以非商业研究及教育为目的，不用作商业用途，欢迎阅读、分享！
参考文献
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